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Gelenkte Evolution mit hohen Mutagenesefrequenzen

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Beim Metabolic Engineering erweisen sich geringe enzymatische Aktivitäten häufig als limitierender Faktor bei der Erhöhung von Syntheserouten über gezielte Stoffwechselwege. Daher sollen Methoden zur Vielfaltsgenerierung und zur Analyse von in dem Zusammenhang limitierenden Enzymen bestimmter Stoffwechselwege verbessert werden, um Titer zu erhöhen. Im Einzelnen behandelt das Projekt die Weiterentwicklung eines neuartigen durchflusszytometriebasierten Durchmusterungsverfahrens, welches auf der Ausbildung einer fluoreszierenden Hydrogelhülle auf der Oberfläche von beispielsweise E. coli-Zellen basiert und mit einem Durchsatz von circa 107 Varianten pro Stunde zur Erforschung von neuartigen Strategien für die Gelenkte Evolution mit hohen Mutagenesefrequenzen eingesetzt werden kann. Hohe Mutagenesefrequenzen eröffnen die Möglichkeit, Aminosäuresubstitutionen zu identifizieren, die in Wechselwirkung stehen und mit normalen Strategien der Gelenkten Evolution nicht gefunden werden können. Zwei Enzyme sollen auf Basis des Stoffwechselweg-Engineerings ausgewählt werden. Die beiden ausgewählten Enzyme sollen für Experimente zur Optimierung des durchflusszytometriebasierten Durchmusterungsverfahrens verwendet werden, während entsprechende Knockout-Stämme zur Quantifizierung der hintergrundreaktionsbedingten Fluoreszenz genutzt werden sollen.