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iVDTv2: Gelenkte Evolution im Hochdurchsatz

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Bei etablierten Verfahren für die Gelenkte Evolution muss man mehrere Tausend Mutanten erzeugen, vermehrt und durchmustern, um für ein Enzym einen bis drei Aminosäureaustausche zu erhalten. 60-80 Prozent der Aminosäureaustausche, die die Eigenschaften des jeweiligen Enzyms verbessern, werden nicht identifiziert. Im Projekt iVDTv2 wird eine Methode für die Gelenkte Evolution entwickelt, mit der man in kurzer Zeit Millionen von Mutanten erzeugen und durchmustern kann. Etablierte Protokolle arbeiten mit Bakterienkulturen.

In der DNA, die die Information für das untersuchte Enzym erhält, werden Zufallsmutationen erzeugt; anschließend werden Bakterien dazu gebracht, die mutierte DNA abzulesen und das Enzym zu produzieren - Genexpression.

Mit einer Reaktion, bei der ein fluoreszierendes Substrat verbraucht wird, wird das Enzym auf die gewünschte Eigenschaft getestet.

Jede Mutante wird in einer eigenen Bakterienkultur exprimiert, damit man sie separat testen und ggf. separat weiter damit arbeiten kann. Das bedeutet: Tausende von Bakterienkulturen anziehen, Tausende von Proteinaufreinigungen durchführen, Tausende von Testreaktionen ansetzen. Der größte limitierende Faktor ist jedoch die Transformationseffizienz. Nicht jedes Gen wird von Bakterienzellen aufgenommen und exprimiert.

Im Projekt iVDTv2 werden in einem einzigen Reaktionsgefäß 107 Mutanten pro Stunde exprimiert und getestet. Die notwendige räumliche Trennung wird durch Emulgierung des Reaktionsansatzes in einer Ölphase errreicht, es entstehen wässrige Tröpfchen die abgeschlossene Reaktionsgefäße darstellen und am Ende durch Zugabe von Detergenz aufgebrochen werden können.

Der emulgierte Reaktionsansatz enthält neben der mutierten DNA alle zur zellfreien Proteinsynthese nötigen Komponenten sowie das fluorogene Substrat als Indikator der Enzymaktivität. Dabei wird die DNA in so hoher Verdünnung zugegeben dass ein Tröpfchen statistisch nur eine Genkopie und damit nur eine Mutante enthält. Im Tröpfchen laufen dann parallel die gekoppelte Transkription-Translation sowie die Indikatorreaktion ab. Tröpfchen mit aktiven und verbesserten Genvarianten werden per Durchflusszytometrie separiert, damit angereichert und schließlich aufgearbeitet. Die enthaltene DNA wird mittels PCR amplifiziert und steht für eine erneute Evolutionsrunde zur Verfügung.