Forschungshighlights

 

Molekulares Verständnis der Interaktionen eines Enzyms und ionischer Flüssigkeiten bietet eine generelle Strategie zur Proteinoptimierung für nachhaltige biokatalytische Anwendungen

Komparative Oberflächenverteilung von Ionen aus ionischen Flüssigkeiten und Wassermolekülen auf der Oberfläche der Bacillus subtilis Lipase A. Urheberrecht: ACS Sustainable Chem. Eng. Komparative Oberflächenverteilung von Ionen aus ionischen Flüssigkeiten und Wassermolekülen auf der Oberfläche der Bacillus subtilis Lipase A.

In dieser Publikation wurden mit Hilfe Molekulardynamik-Simulation die Interaktion der Bacillus subtilis Lipase A (BSLA) mit vier Imidazol-basierten ionischen Flüssigkeiten studiert. Diese Studie bietet erste Hinweise, dass ionische Co-Lösungsmittel die generelle und lokale Konformation des Enzyms nicht beeinflussen. Der Effekt der Aktivitätsreduzierung wurde Oberflächeninteraktionen des Enzyms mit den Kationen der ionischen Lösung zugeschrieben, die essentielle Wassermoleküle auf der BSLA Oberfläche entfernten.

Das molekulare Verständnis der Interaktionen von Enzymen mit ionischen Flüssigkeiten aus computer-basierten Studien ist anwendbar für generelle Proteinoptimierungsstrategien.

Der Vergleich von simulations-basierten Daten mit experimentellen Daten einer vollständigen Sättigunsmutagenese-Bibliothek belegten, dass die meisten Positionen für eine verbesserte Resistenz in der Nähe von Binderegionen für Kationen der ionischen Flüssigkeiten liegen. Zusammengefasst legen diese Analysen nahe, dass die Optimierung von Enzym-Oberflächenladungen eine generelle Strategie für die Verbesserung der BSLA in ionischen Flüssigkeiten darstellen könnte und das diese Strategie auch auf weitere Lipasen und α/β-Hydrolasen übertragbar sein könnte.

  Dr. Gaurao Dhoke und Subrata Pramanik Urheberrecht: BIO VI Subrata Pramanik (links) und Dr. Gaurao Dhoke (rechts).

Pramanik S., Dhoke G. V., Jaeger KE., Schwaneberg U., Davari MD. ACS Sustainable Chem. Eng., 2019, https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.9b00752 geteilte Erstautorschaft

Diese Arbeit wurde in der Abteilung Computational Biology durchgeführt und wurde durch JARA-HPC der RWTH Aachen (JARA0187) finanziell unterstützt.

 
 

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Science würdigt unsere jüngsten Forschungsarbeiten zum Pflanzenschutz

Regenresistenter Pflanzenschutz durch Funktionalisierung der Blattoberfläche mit Dipeptiden Urheberrecht: Green Chemistry

Die BiFuProt-Oberflächenbeschichtungsplattform wurde in einem kürzlich vom Fachmagazin Science veröffentlichten Presseartikel als neue Pflanzenschutztechnologie hoch gelobt. Der Science-Artikel zitierte führende Pflanzenwissenschaftler: "With the current scale of the soybean rust problem, and the rapid evolution of resistance against multiple fungicides, any addition to the toolbox would be welcome", sagt Nichola Hawkins von Rothamsted Research in Harpenden, Großbritannien, und Ralph Hückelhoven von der Technischen Universität München wird zitiert: "It opens a treasure box of solutions".

Der Pflanzenschutz mittels Pestiziden steht oft vor der Herausforderung, dass Pestizide eine sehr geringe Verweildauer und Regenfestigkeit auf den Pflanzenblättern aufweisen. Die Reduktion der eingesetzten Pestizidmenge bei gleichbleibendem Ernteertrag bedarf der Entwicklung neuer Strategien in der Schädlings- und Krankheitsbekämpfung. In unserem aktuellen Forschungshighlight, das in der Zeitschrift Green Chemistry veröffentlicht wurde, haben wir eine Plattformtechnologie entwickelt, die die Funktionalisierung der Pflanzenoberfläche für ein nachhaltiges Krankheitsmanagement ermöglicht. Wir zeigten einen alternativen Weg, Sojabohnenblätter vor dem asiatischen Sojarost (Phakopsora pachyrhizi) zu schützen, indem die Blätter mit bifunktionalen Fusionsproteinen oder kurz BiFuProts funktionalisiert werden.

"With the current scale of the soybean rust problem, and the rapid evolution of resistance against multiple fungicides, any addition to the toolbox would be welcome."

- Nichola Hawkins (Rothamsted Research, Harpenden, Großbritannien)

Die erste Domäne der BiFuProts bindet an die Wachsschicht der Pflanzenblätter und die zweite Domäne verhindert die Keimung von Phakopsora pachyrhizi Sporen. Im Detail wurden die amphiphilen Ankerpeptide LCI, Thanatin, Tachystatin A2 und Lactoferricin B genetisch mit dem Reporterprotein eGFP fusioniert und auf die Bindung von Pflanzenblättern untersucht. eGFP-LCI und eGFP-Thanatin binden regenfest an die Oberfläche von Soja-, Gersten- und Maisblättern. Insbesondere widerstand das an Sojablätter gebundene eGFP-Thanatin hohen Temperaturen, Sonnenlicht und biologischem Abbau über einen Zeitraum von mindestens 17 Tagen. Eine schwache Bindung von eGFP-LCI und eGFP-Thanatin an die Blätter einer Gerste-Variente mit stark reduzierten Waxen auf der Blattoberfläche lässt vermuten, dass die Peptide hauptsächlich an die Wachsschicht der Blätter binden. Als Fusionspartner für Thanatin wurde das antimikrobielle Peptid Dermaseptin 01 ausgewählt. Das bifunktionelle Peptid Dermaseptin 01-Thanatin inhibierte die Sporenbildung von Phakopsora pachyrhizi in vitro und reduzierte die Ausbildung der Symptome des Asiatischen Sojabohnenrosts. Es ist sehr wahrscheinlich, dass modernste Protein-Engineering-Strategien wie PePevo in Kombination mit einer KnowVolution-Kampagne das Design von Peptiden mit maßgeschneiderter Bindungsstärke und Persistenz ermöglichen werden, die den Anforderungen der Anwendung entsprechen. Wir gehen davon aus, dass bifunktionale Peptide oder Proteine, die aus Ankerpeptiden (Blattbinding) und antimikrobiellen Peptiden oder Proteinen (Pestizid) bestehen, das Potenzial besitzen eine Vielzahl an Pflanzenschädlingen und Krankheiten zu bekämpfen.

Diese innovative Forschung wurde im Rahmen des Bioeconomy Science Center (BioSC) durchgeführt, das vom Ministerium für Kultur und Wissenschaft des Landes Nordrhein-Westfalen im Rahmen des NRW-Strategieprojekts BioSC gefördert wurde. Das BiFuProts (Bifunktionale Fusionsproteine für den Pflanzenschutz; BOOST FUND Projekt) Team bestand aus Professor Ulrich Schwaneberg und Dr. Felix Jakob (Initiator/Koordinator; RWTH Aachen Universität), Professor Uwe Conrath und Dr. Caspar Langenbach (RWTH Aachen Universität), Professor Lutz Schmitt (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf) und Professor Georg Noga, Dr. Mauricio Husche und Dr. Shyam Pariyar (Universität Bonn).

"It opens a treasure box of solutions"

- Ralph Hückelhoven (Technische Universität München)

Die Pflanzengesundheit ist bereits seit fünf Jahren ein aufstrebendes Forschungsgebiet innerhalb der Schwaneberg-Gruppe in enger Zusammenarbeit mit Pflanzenwissenschaftlern und Chemikern. Die Freisetzung von Pflanzennährstoffen wurde am Beispiel des Eisenmangels in Gurken im BioSC-Projekt GreenGel erfolgreich demonstriert. Dr. Felix Jakob und Professor Schwaneberg (Koordinator; RWTH Aachen Universität) haben sich im GreenGel-Projekt mit Professor Pich (RWTH Aachen Universität) und Professor Goldbach (Universität Bonn) zusammengeschlossen. Die GreenRelease-Technologie basiert auf den verbindungsbeladenen Mikrogelen (Behältern), die mit Ankerpeptiden (Blattbindung) dekoriert werden und in 2017 in der Angewandte Chemie als Hot Paper veröffentlicht wurden. Basierend auf dem Erfolg der GreenGel- und BiFuProts-Projekte wurde das FocusLab greenRelease for Plant Health für die translationale Forschung (2,3 Mio. €; ab Januar 2018 für drei Jahre) bewilligt. In dem BioSC-FocusLab haben wir uns mit den Gruppen von Professor Pich (RWTH Aachen Universität), Professor Conrath (RWTH Aachen Universität), Professor Noga (Universität Bonn), Professor Bröring (Universität Bonn), Professor Knief (Universität Bonn), Professor Groth (HHU Düsseldorf), Professor Gohlke (HHU Düsseldorf) und Professor Schurr (Forschungszentrum Jülich) zusammengeschlossen, um in den kommenden Jahren bahnbrechende Forschungsarbeiten im Bereich der Pflanzengesundheit und des Pflanzenschutzes durchzuführen.

 

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Maßgeschneiderter Membrankanal ermöglicht chirale Trennung von Racematen

Foto von Deepak Anand Urheberrecht: BioVI Deepak Anand

Deepak Anand, Gaurao V. Dhoke, Julia Gehrmann, Tayebeh M. Garakani, Mehdi D. Davari, Marco Bocola, Leilei Zhu und Ulrich Schwaneberg, Chemical Communications, 2019. DOI: 10.1039/c9cc00154a.

Die chirale Trennung der Argininenantiomere wurde durch das maßgeschneiderte Escherichia coli Membranprotein FhuA erreicht.

  Schematische Darstellung der chiralen Trennung eines Arginin-Racemats durch den entwickelten FhuA-Kanal. Urheberrecht: Chem. Commun. Schematische Darstellung der chiralen Trennung eines Arginin-Racemats durch den entwickelten FhuA-Kanal.

Chirale Moleküle sind von großem wirtschaftlichen Wert in der chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie. Die Trennung von Enantiomeren kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden, bleibt aber dennoch eine anspruchsvolle Aufgabe. Chirale Protein-Polymer-Membranen wären eine attraktive, kostengünstige und skalierbare Alternative für die chirale Trennung. Die größten Herausforderungen liegen in der Gestaltung von Filterregionen innerhalb der Kanalproteine und der Entwicklung von Durchmusterungssystemen zur Identifizierung chiraler Kanalproteinvarianten. In der vorliegenden Studie berichten wir zum ersten Mal über ein chirales Kanalprotein aus β-Faltblättern, basierend auf Ferric hydroxamate uptake component A - FhuA, einem Außenmembranprotein von E. coli. Zwei Filterregionen wurden identifiziert und durch die Durchmusterung von Sättigungsmutagenesebibliotheken maßgeschneidert, um die chirale Trennung eines D-/L-Argininin-Racemats zu erreichen. Die Durchmusterung führte zur Identifizierung der FhuAF4-Variante, die einen verbesserten enantiomeren Überschuss von 24% bei 52% Umsatz im Vergleich zur Wildtyp-FhuA-Variante zeigte. Interessanterweise hat schon eine kleine Veränderung von nur zwei Aminosäuren die Selektivität des FhuA-Kanals erheblich beeinflusst. Gesteuerte molekulardynamische Simulationen zeigten, dass die Trennung auf Diffusionsdifferenzen der beiden Enantiomere durch FhuAF4 basiert. Es ist wahrscheinlich, dass mit der identifizierten Filterregion und den Sättigungsbibliotheken weitere Verbesserungen bei der Trennung anderer Aminosäuren und einem breiteren Spektrum an Enantiomeren möglich sind. Die chiralen FhuA-Kanalproteine wären eine hervorragende Arbeitsplattform für die Herstellung von chiralen Membranen auf Basis von Protein-Polymer-Konjugaten mit hohem Potenzial für neuartige und skalierbare Downstream-Prozesse.

Wir danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) für die finanzielle Unterstützung des Projekts Chirale Membranen I. Die Simulationen wurden mit Rechenressourcen durchgeführt, die von JARA-HPC von der RWTH Aachen im Rahmen des Projekts RWTH0116 gewährt wurden.

 

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Biohybridkatalysatoren für sequenzielle Eintopfsynthesen basierend auf einem engineerten Transmembranprotein

Dr. Daniel Sauer Urheberrecht: BioVI Dr. Daniel Sauer

D. F. Sauer, Y. Qu, M. A. S. Mertens, J. Schiffels, T. Polen, U. Schwaneberg*, J. Okuda*, Catal. Sci. Tech. 2019, 9, 942-946. DOI: 10.1039/C8CY02236D

Kompartmentalisierung von organometallischen Katalysatoren wurde durch die Bildung ihrer jeweiligen Biohybridkatalysatoren basierend auf dem Transmembranprotein FhuA erreicht, um Reaktionskaskaden zu ermöglichen.

 
  Schema der Biohybridkatalysator-Reaktion als Eintopfsystem Urheberrecht: Catal. Sci. Tech. Synthese von Bibenzylderivaten ausgehend von Styrolderivaten in einem Eintopfsystem

In dieser Publikation zeigen wir, dass die Einbettung von organometallischen Katalysatoren in Proteingerüste Kaskadenreaktionen im Eintopfverfahren ermöglicht, die durch einfaches Mischen der proteinfreien Katalysatoren nicht möglich wäre. Bibenzylderivate (1,2-Diphenylethanderivate), die wertvolle Komponenten in der Medikamentenentwicklung darstellen und als Bausteine für die Synthese von Naturstoffen verwendet wurden, sind ausgehend von Styrolderivaten synthetisiert worden. Im ersten Schritt wurde Olefin-Kreuzmetathese von Stryrolderivaten mithilfe eines Ru-basierten Grubbs-Hoveyda-Katalysators durchgeführt. Im nachfolgenden Schritt wurde die Hydrogenierung des Stilbenintermediates mittels eines Rh-Katalysators ermöglicht, ohne Stilben zuvor aufreinigen zu müssen. Diese Route war nicht durch einfaches Mischen der zwei organometallischen Katalysatoren in einem Topf möglich. Die Strategie, die organometallischen Katalysatoren mit Proteinen zu kompartmentalisieren, ist ein aussichtsreicher Ansatz und bietet die Möglichkeit die Reaktion homogen durchzuführen. Letzteres beseitigt Diffusionsbarrieren durch Massentransfer zwischen den Phasen. Diese Arbeit wurde in der Next Generation Biocatalysis Gruppe in Kooperation mit Professor Jun Okuda (Institut für Anorganische Chemie, RWTH Aachen University) durchgeführt. Die Studien wurden durch DFG und BMBF finanziell gefördert. Umicore, Frankfurt, wird für die großzügige Spende von Metallvorstufen gedankt.

 

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Gelenkte Evolution einer bakteriellen Laccase für enzymatische Biokraftstoffzellen

Dr. Lingling Zhang Urheberrecht: BioVI

Lingling Zhang, Haiyang Cui, Zhi Zou, Tayebeh Mirzaei Garakani, Catalina Novoa-Henriquez, Bahareh Jooyeh und Ulrich Schwaneberg, Angew. Chem. Int. Ed, 2019. DOI: 1002/ange.201814069

Die gelenkte Evolution von CueO durch elektrochemisches Screening identifizierte Substitutionen, die zu einem dramatischen Rückgang der Überspannung von 0,12 V führten und dabei CueO wettbewerbsfähig gegenüber Pilzlaccasen machte sowie in enzymatischen Biokraftstoffzellen anwendbar ist.

 
  Darstellung der Methoden und Ergebnisse der Publikation Urheberrecht: Angew. Chem. Int. Ed Schematische Darstellung der elektrochemischen Screeningplattform, Strukturansicht des Kupfers und der angrenzenden Reste von CueO und elektrokatalytische Polarisationskurven in Bezug auf den CueO-Wildtyp und die CueO-Variante D439T/L502K.

In dieser Studie wurde die bakterielle Laccase CueO von Escherichia coli ausgewählt, um eine gelenkte Evolution zur Senkung des Überpotentials der kathodischen Sauerstoffreduktion durchzuführen. Eine robuste und effiziente elektochemische 8-Kanal Screening-Plattform wurde erstmals entwickelt, um CueO-Varianten zu bewerten, die durch zufällige Mutagenese und anschließende Sätigungsmutagenese erzeugt werden. Die Enzymimmobilisierung konnte dabei in 20 Sekunden und direkt aus Rohzelllysaten durchgeführt werden. Zwei Positionen in der Nähe der koordinierten Liganden des T1-Kupfers wurden als Hauptregion identifiziert, die zu einer Verbesserung des Anfangspotenzials beitragen. Mit einer doppelten Substitution in CueO wurde ein bemerkenswert erhöhtes Anfangspotenzial von 0,54 V erreicht. Schließlich erzeugte die Kathode ein Leerlaufpotenzial von 0,56 V sowie eine 1,72-fach erhöhte Leistungsabgabe für die enzymatische Biokraftstoffzelle, die die erzeugte CueO-Variante in Verbindung mit einer Glukosedehydrogenase umfasst. Das entwickelte gelenkte Evolutionsprotokoll bietet eine vielversprechende Methodik jenseits von Chemie und Materialwissenschaft, um die Laccase-Eigenschaften wie Substratspezifität, Umsatzeffizienz und Toleranz gegenüber harschen Umgebungsbedingungen zu verbessern.

Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung unterstützt.

 

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Zielgerichteter Mikroplastik-Abbau in hochverdünnten Suspensionen

Fotos von Shohana Islam und Lina Apitius Urheberrecht: BioVI

Shohana Islam#, Lina Apitius#, Felix Jakob und Ulrich Schwaneberg. 2019, Environ. Int. 123: 428-435. #geteilte Erstautorschaft. DOI.org/10.1016/j.envint.2018.12.029

In der vorliegenden Veröffentlichung wird die Verwendung des Ankerpeptids Tachystatin A2 als Adhäsionsvermittler beschrieben, das einen Abbau von Polyester-Polyurethan Nanopartikeln durch die Cutinase Tcur1278 beschleunigt.

 
  Feldrasterelektronenmikroskopisches Bild des Mikroplastik-Abbaus durch Cutinasen Urheberrecht: Environ. Int. Feldrasterelektronenmikroskopische Aufnahme des enzymatischen Abbaus von Polyester-Polyurethan nach 24 h. Nur bei Behandlung mit dem Cutinase-Ankerfusionsprotein ist ein Abbau des Materials zu erkennen.

Die Akkumulierung von Mikroplastik in der Umwelt und in der Nahrungskette werden in Zukunft eine große Herausforderung für unsere Gesellschaft darstellen. Zu den akkumulierenden Plastiken gehören auch Polyurethane als weit verbreitete synthetische Polymere, die sowohl in Medizinprodukten, z.B. Katheter, als auch in Industrieprodukten, z.B. Schäume, eingesetzt werden. Da Polyurethane nicht natürlich in der Umwelt vorkommen, gibt es nur wenige Pilz- oder Bakterienstämme oder Enzyme wie Polyurethaneasen und Cutinasen, die in der Lage sind, diese Polymere effizient abzubauen. Der Abbau von Plastik in der Natur umfasst nach Schätzwerten verschiedener Literaturangaben eine Zeitspanne von mindestens 50-100 Jahren. Eine Minimierung der bereits bestehenden Umweltverschmutzung durch Mikroplastik bedarf der Entwicklung nachhaltiger Managementstrategien. Materialbindepeptide wie Ankerpeptide zeigen eine verstärkte Bindung an synthetische Polymere wie Polypropylen, Polyethylenterephthalat und Polyurethan. In dieser Veröffentlichung berichten wir über die Fusion des Ankerpeptids Tachystatin A2 an die bakterielle Cutinase Tcur1278. Im Vergleich zu der Wildtyp Cutinase Tcur1278 ohne ein Ankerpeptid beschleunigte das Fusionsprotein Tcur1278-Tachystatin A2 den Abbau von Polyester-Polyurethan-Nanopartikeln um den Faktor 6,6. Zusätzlich verringerte sich die Abbau-Halbwertszeit der Polyester-Polyurethan-Nanopartikel Suspension von 41,8 Stunden auf 6,2 Stunden, was einem Beschleunigungsfaktor von 6,7 entsprach. Zusammengefasst bieten die Ankerpeptide eine vielseitige Plattform für den gezielten Abbau von Mikro- und Nanoplastik bei Umgebungstemperatur in stark verdünnten Partikelsuspensionen.

Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung sowie von der Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen finanziert. Wir bedanken uns bei Prof. Wolfgang Zimmermann und Dr. Ren Wei für die Bereitstellung der Sequenz der Cutinase Tcur1278. Wir danken Thorsten Palmer für die dynamische Lichtstreuung-Messungen und schließlich dem Zentrum für chemische Polymertechnologie, insbesondere Sabrina Mallmann, für die Feldrasterelektornenmikroskopie.

 

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Auf dem Weg zur Evolution künstlicher Metalloenzyme - Eine Proteiningenieur-Perspektive

Fotos von Ulrich Markel und Daniel Sauer Urheberrecht: BioVI

Ulrich Markel,# Daniel F. Sauer,# Johannes Schiffels, Jun Okuda und Ulrich Schwaneberg, Ang. Chem. Int. Ed., 2018 , DOI: 10.1002/ange.201811042

In der vorliegenden Veröffentlichung wird ein Überblick über die frühen Ansätze der gelenkten Evolution von Biohybridkatalysatoren gegeben.

 
  Schema zur gelenkten Evolution von Biohybridkatalysatoren Urheberrecht: Ang. Chem. Gelenkte Evolution künstlicher Metalloenzyme/Biohybridkatalysatoren. Im Gegensatz zur gelenkten Evolution natürlicher Enzyme erfordert die gelenkte Evolution künstlicher Metalloenzyme/Biohybridkatalysatoren zwei zusätzliche Schritte (orange).

Der Einbau von künstlichen Metallkofaktoren in Proteingerüste führt zu einer neuen Klasse von Katalysatoren, die als Biohybridkatalysatoren oder künstliche Metalloenzyme bezeichnet werden. Diese Biohybridkatalysatoren können sowohl am künstlichen Cofaktor, als auch an der zweiten Koordinationssphäre, das heißt dem Proteingerüst, modifiziert werden. Protein-Engineering bietet ein enormes Potenzial, um solche Biohybridkatalysatoren maßzuschneidern, erfordert jedoch ein robustes Screening-System und eine wohldurchdachte Metallkofaktor-Konjugationsstratie. In diesem Kurzaufsatz geben wir einen Überblick über die jüngsten Bemühungen auf diesem Gebiet. Wir beschreiben Hochdurchsatz-Screening-Methoden, die für die gelenkte Evolution von Biohybridkatalysatoren angewendet werden und wir veranschaulichen, wie nicht-chirale Katalysatoren Reaktionen enantioselektiv katalysieren, indem wir die ersten Erfolge auf diesem sich entwickelnden Gebiet aufzeigen. Darüber hinaus fassen wir das Potenzial und die bisherigen Limitationen zusammen, die überwunden werden müssen, um von Biohybridkatalysatoren zu echten künstlichen Metalloenzymen zu gelangen.

Finanzielle Förderung von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) durch die internationale Graduiertenschule „Selekitvität in Chemo- und Biokatalyse“ (SeleCa) und durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, FKZ: 031B0297) wird dankend anerkannt. #: Diese Autoren haben gleichermaßen zu diesem Kurzaufsatz beigetragen.

 

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Enzym-Polyelektrolyt-Komplexe erhöhen die katalytische Leistung von Enzymen

Photo von Martin Thiele und Mehdi D. Davari Urheberrecht: Bio VI

Martin J. Thiele, Mehdi D. Davari, Melanie König, Isabell Hofmann, Niklas O. Junker, Tayebeh Mirzaei Garakani, Ljubica Vojcic, Jörg Fitter, Ulrich Schwaneberg, ACS Catalysis, 2018, DOI: 10.1021/acscatal.8b02935

In der vorliegenden Veröffentlichung wird über das molekulare Verständnis von Polyelektrolyt-Enzym-Komplexen berichtet, die die enzymatische Aktivität in Mehrkomponentensystemen verstärken.

 
  Schema des verstärkenden Effektes durch Polyelektrolyten auf Proteasen Urheberrecht: ACS Verstärkung der katalytischen Leistung der Protease 1ST3 durch die Interaktion des Polyelektrolyten mit Oberflächenaminosäuren nahe der Ca2+ Bindestelle der Protease

In dieser Veröffentlichung wurde ein molekulares Verständnis der verstärkenden Wirkung von Polyacrylsäure, PAA, und γ-Polyglutaminsäure, γ-PGA auf eine unspezifische Subtilisin Protease durch biophysikalische Charakterisierung, z.B. Fluoreszenzkorrelations- und Circulardichroismus-Spektroskopien sowie isotherme Titrationskalorimetrie, Molekulardynamiksimulationen und Protease-Engineering, z.B. Ortssättigungsmutagenese, geschaffen. Diese Studie zeigte, dass enthalpisch getriebene Wechselwirkungen über Schlüssel-Aminosäurereste in der Nähe der Protease-Ca2+-Bindungsstellen den Verstärkungseffekt in der Protease-Aktivität verursachen. Auf molekularer Ebene führen elektrostatische Wechselwirkungen zur Bildung von Protease-Polyelektrolyt-Komplexen. Eine Sättigungsmutagenese an 6 Positionen führte zu Varianten mit erhöhter proteolytischer Leistung gegenüber einer komplexen Proteinmischung mit dem Handelsnamen CO3 um bis zu ~ 300% und ~ 70% in Anwesenheit von PAA und γ-PGA. Die Fähigkeit, die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und negativ geladenen Polymeren durch integrativen Einsatz von Computerdesign, Protein-Engineering und biophysikalischer Charakterisierung zu optimieren, erwies sich als effizienter Arbeitsablauf zur Verbesserung der Proteaseleistung.

Diese Forschung wurde teilweise von der Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf, Deutschland, im Rahmen des Projekts Henkel Innovation Campus für Advanced Sustainable Technologies (HICAST) finanziert. Simulationen wurden mit Rechenressourcen durchgeführt, die von JARA-HPC durch die RWTH Aachen University im Rahmen der Projekte RWTH0116 und JARA0169 erteilt wurden.

 

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Gelenkte Evolution von Sortase A für effiziente ortspezifische Biokonjugationen in organischen Lösungsmitteln

Photo von Zhi Zou Urheberrecht: Bio VI

Die gelenkte Evolution der Sortase A in 45% (v/v) DMSO als Lösungsmittel, ergab die Varianten M1 und M3 mit jeweils 2,2-fach erhöhter Resistenz und 6,3-facher katalytischer Effizienz im Vergleich zum Sortase A-Wildtyp. Die generieten Varianten wurden zur Erweiterung der Sortase-vermittelten Ligation im organischen Lösungsmittel mit hydrophoben Substraten eingesetzt. Die Variante M3 zeigte eine bis zu 4,7-fach erhöhte Aktivität für Peptid-Peptid/Peptid-Amin Bindungen in DMSO/DMF Cosolventien im Vergleich zum Wildtyp. Die Struktur-Funktionsanalyse der Sortase in DMSO durch computergestützte Studien zeigte, dass die Konformationsmobilität wichtig für die erhöhte Resistenz der Sortase A im organischen Lösungsmittel ist.

 
  Schema der Gelenkten Evolution von Sortase A Urheberrecht: Royal Society of Chemistry Schematische Darstellung der Sortase A -M3 vermittelten ortsspezifischen Ligation im organischen Lösungsmittel

Diese Studie wurde von der chinesischen Stipendienrat-CSC finanziert. Simulationen wurden mit Rechenressourcen durchgeführt, die von JARA-HPC der RWTH Aachen im Rahmen der Projekte RWTH0116 und JARA0169 erteilt wurden.

Weitere Informationen zu dieser Publikation finden Sie unter Forschungshighlights und auf der Webseite von Chemical Communications.

 
 

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KnowVolution-Kampagne einer Arylsulfotransferase erhöht die Aktivität für Cellobiose-Sulfatierung

Photo von Shohana Islam Urheberrecht: Bio VI Shohana Islam, Erstauthorin der Studie zum Thema KnowVolution Kampagne einer Arylsulfotransferase für Cellobiose-Sulfatierung

Islam, S., Laaf, D., Infanzón, B., Pelantová, H., Davari, M. D., Jakob, F., Křen, V., Elling, L., and Schwaneberg, U. Chemistry - A European Journal , 2018. doi:10.1002/chem.201803729

Glykosaminoglykane sind meist sulfatierte Polysaccharide, die eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion, Antikoagulation, Entgiftung und vielem mehr spielen. Die vollständige chemische Synthese von Glykosaminoglykanen ist aufgrund der vielen Syntheseschritte, die die finale Ausbeute beeinflussen, immer noch eine sehr schwierige Aufgabe. Eine geeignete und nachhaltige Alternative stellt die in vitro-Synthese von sulfatierten Polysacchariden wie Cellulose oder Chitin dar, die die Funktionalitäten von Glykosaminoglykanen aufweisen. Enzymatische Sulfatierung der Polysaccharid-Bausteine durch Sulfotransferasen ist aufgrund ihrer Fähigkeit zur hochchemoselektiven Sulfatierung in wässriger Lösung und bei Raumtemperatur synthetisch attraktiv. Die bakterielle Arylsulfotransferase B - ASTB wurde maßgeschneidert, um die Sulfatierungsaktivität gegenüber dem Cellulose-Baustein, der Cellobiose, zu verbessern. Hierzu wurde eine vollständige KnowVolution-Kampagne durchgeführt. Nach der Durchmusterung von 3067 ASTB-Varianten wurden Leu446 und Val579 als wichtige Positionen identifiziert, die positive Auswirkungen auf die ASTB-Aktivität zeigen

 
Schema für Sulfatierung von Zucker und Glykosaminoglykanen Urheberrecht: Bio VI Figur: ASTB wurde mittels KnowVolution zu einem vielseitigen Werkzeug für die Sulfatierung von Zucker und Glykosaminoglykanen maßgeschneidert.

Weiterentwicklung einer Arylsulfotransferase zu einem synthetisch attraktiven Sulfatierungsmittel für Zucker

Computergestützte Studien deuten darauf hin, dass die Substitution Leu446Pro mehr Flexibilität an der Substratbindetasche ermöglicht und Val579Lys eine distale Substitution ist. Schließlich ergab die Rekombination von Leu446Pro und Val579Lys die Variante ASTB-M5 mit bis zu 7,6-fach erhöhter spezifischer Aktivität im Vergleich zum Wildtyp für Cellobiose. Eine Monosulfatierung von Cellobiose wurde mittels Massenspektrometrie bestätigt, was auf einen hohen Selektionsgrad hinweist. Darüber hinaus wurde der Umsatz bei der Synthese des monosulfatierten Glykosaminoglykan-Bausteins, N-Acetylglucosamin von 33,8% auf 87,1% erhöht. Die Strukturaufklärung bestätigte eine teilweise regioselektive Monosulfatierung an den Positionen C-3 und C-4, im Gegensatz zur chemisch bevorzugten Position C-6.

Diese Arbeit war eine erfolgreiche Zusammenarbeit zwischen Professor Schwaneberg und Professor Elling von der RWTH Aachen, sowie Professor Křen von der Tschechischen Akademie der Wissenschaften. Unsere Arbeit wurde durch die Projekte FuPol, BioSulfa und das Bundesministerium für Bildung und Forschung finanziert. Weitere Informationen zu dieser Publikation finden Sie unter Forschungshighlights und auf der Webseite von Chemistry – A European Journal.

 
 

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Gelenkte OmniChange Evolution verwandelt P450 BM3 in eine Alkyltrimethylammonium-Hydroxylase

Photo von Yu Ji Urheberrecht: Bio VI Yu Ji, Erstauthorin der Studie zum Thema Gelenkte OmniChange Evolution von P450 BM3 zu einer Alkyltrimethylammonium-Hydroxylase

Yu Ji, Alan Maurice Mertens, Christoph Gertler, Sallama Fekiri, Merve Keser, Daniel F. Sauer, Kilian E. C. Smith, and Ulrich Schwaneberg*, Chemistry - A European Journal, 2018, doi:10.1002/chem. 201803806

 
 

Reengineering der P450 BM3 Substratspezifität zur Hydroxylierung von CTAB durch die OmniChange Multi-Site Mutagenesemethode

 
  Abbildung der Substrate und Produkte der Reaktion Urheberrecht: Chemistry – A European Journal Gelenkte OmniChange Evolution verwandelt P450 BM3 in eine Alkyltrimethylammonium-Hydroxylase.

Bolatenside sind eine neue Klasse von Verbindungen mit einer breiten Palette von industriellen und technischen Anwendungen. Sie sind in der Lage, sehr kleine Micellen zu bilden und daher wirksamer als moderne Tenside.

Ihre Herstellung ist jedoch teuer und erfordert die Verwendung von starken Säuren und großen Mengen an Lösungsmitteln. Ein alternativer grüner Syntheseweg ist die direkte Hydroxylierung durch Monooxygenasen, wie sie in der Natur durchgeführt wird.

 
 

In dieser Studie wurde die OmniChange Multi-Site-Mutagenesemethode zum Reengineering der P450 BM3-Substratspezifität zur Hydroxylierung von CTAB durch gleichzeitige Mutagenese von vier relevanten Positionen angewendet. Verbesserte Varianten wurden in einem zweistufigen Screeningsystem identifiziert. Anschließend wurden 10 aktive Varianten durch HPLC-MS/MS analysiert. Vier P450 BM3-Varianten wiesen signifikant verbesserte Produktivitäten auf und wurden kinetisch charakterisiert.

Interessanterweise waren alle vier Varianten zu di-Hydroxylierung von CTAB fähig und Kopplungseffizienzen von 92.5% wurden erreicht. Insbesondere wurden erstmals Dihydroxylierungsprodukte von CTAB mit Bolatensideigenschaften hergestellt. Bolatenside sind biologisch abbaubare und nachhaltige Tenside mit ausgezeichneten Löslichkeitseigenschaften, die neue Möglichkeiten der Drug-Delivery und/oder Formulierung bieten. Darüber hinaus erwies sich das zweistufige Screening-System als effizient, um die Kopplungseffizienz zu erhöhen, und kann wahrscheinlich in vielen anderen P450-Evolutionskampagnen verwendet werden, um robuste P450-Katalysatoren zu erzeugen. Diese Arbeit wurde druch das China Scholarship Council, Nr. 201608080082, gefördert.

Den Link zu dieser Publikation finden Sie hier.

 
 

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Enzymkompatible dynamische Nanoreaktoren aus elektrostatisch verbrückten gleichgeladenen Tensiden und Polyelektrolyten

Photo von Martin Thiele und Mehdi D. Davari Urheberrecht: Bio VI

Martin J. Thiele, Mehdi D. Davari, Isabell Hofmann, Melanie König, Carlos G. Lopez, Ljubica Vojcic, Walter Richtering, Ulrich Schwaneberg und Larisa A. Tsarkova, Angewandte Chemie, 2018, DOI: 10.1002/anie.201805021

 
 

In unserer neusten Veröffentlichung wird über die Entdeckung von Nanoreaktoren aus elektrostatisch verbundenen Tensiden und Polyelektrolyten gleicher Ladung berichtet. Der Einbau einer Protease in solche dynamischen Nanoreaktoren führt zu einer synergistisch verbesserten Reinigungsleistung aufgrund der verbesserten Solubilisierung und Zugänglichkeit für die Protease durch die Wechselwirkung mit den Nanoreaktor-Komponenten.

 
 

In der Publikation wird von einem völlig unerwarteten Mechanismus von sich anziehenden elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen vollständig neutralisierter Polyacrylsäure und gleich geladenen Tensiden berichtet. Amphiphile Polymer-Tensid-Komplexe mit hoher Grenzflächenaktivität und einer Solubilisierungskapazität, die die herkömmlicher Mizellen übersteigt, werden durch Brückenbildung mit Kalzium-Ionen gebildet. Der Einbau einer unspezifischen Protease in solche dynamischen Nanoreaktoren führt zu einer synergistisch verbesserten Reinigungsleistung aufgrund der verbesserten Solubilisierung von schlecht wasserlöslichen immobilisierten Proteinen. Konkurrierende Grenzflächen- und intermolekulare Wechselwirkungen wurden auf verschiedenen Zeit- und Längenskalen mit kolorimetrischen Analysen, dynamischer Tensiometrie, Lichtstreuung und molekulardynamischen Simulationen untersucht. Der hier entdeckte Mechanismus der verbrückenden Assoziation schlägt eine Neugestaltung von Tensid / Polymer / Enzym-Formulierungen moderner Detergenzien vor und eröffnet neue Möglichkeiten bei der Entwicklung labiler Abgabesysteme.

 
  Schema des Mechanismus der Nanoreaktoren Urheberrecht: Bio VI

Links: Schema des Mechanismus von anziehenden elektrostatischen Wechselwirkungen vollständig neutralisierter Polyacrylsäure (PAA) mit dem gleich-geladenen Tensid SLES. Amphiphile Polymer-Tensid-Komplexe mit hoher Grenzflächenaktivität und Solubilisierungskapazität werden durch Brückenbildung mit Ca 2+ -Ionen gebildet. Einbau einer Protease in solche dynamischen Nanoreaktoren führt aufgrund der verbesserten Solubilisierung von schlecht wasserlöslichen immobilisierten Proteinen zu verbesserter Reinigungsleistung.

 
 

Diese Forschung wurde teilweise von der Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf, Deutschland, im Rahmen des Henkel Innovation Campus für Advanced Sustainable Technologies (HICAST) finanziert. Simulationen wurden mit Rechenressourcen durchgeführt, die von JARA-HPC der RWTH Aachen im Rahmen der Projekte RWTH0116 und JARA0169 erteilt wurden. L.A.T. würdigt die finanzielle Unterstützung der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (RFBR) gemäß dem Forschungsprojekt Nr. 18-53-76005.

 
 

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  Schema des Loop Engineering - Versuches Urheberrecht: Royal Society of Chemistry
 
 

Eine Entropieanalyse zeigte, dass die Substitution von Alanin an jeder ausgewählten Aminosäureposition A285, A310, A312 und A318 die Flexibilität der Schleife L1 reduziert. Die Analyse mit dem ConSurf-Server zeigte, dass die lange Domänenverbindungsschleife L1 ein konserviertes Merkmal in pilzlichen Laccasen ist, was das Schleifen-Engineering als nützliche Strategie zum Erhöhen der Laccase-Aktivität in ionischen Flüssigkeiten und wässrigen Lösungen nahelegt. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft - DFG - im Rahmen des Forschungsclusters "Maßgeschneiderte Kraftstoffe aus Biomasse" gefördert.

 
 

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Hohlraumvolumen-Engineering eines Beta-Fassproteins generiert effiziente Biohybridkatalysatoren für Olefinmetathese

Photo von Alexander Grimm und Daniel Sauer Urheberrecht: Bio VI

Grimm, A.R.*, Sauer, D.F.*, Davari, M.D., Zhu, L., Bocola, M., Kato, S., Onoda, A., Hayashi, T., Okuda, J., Schwaneberg, U.; ACS Catalysis, 2018, 8, pp 3358–3364, DOI: 10.1021/acscatal.7b03652. (*gleichermaßen beigetragen)

 

Die erfolgreiche Anwendung der präsentierten Hohlraumvolumen-Engineering Strategie auf die Biohybridkatalyse kann potentiell auf weitere Beta-Fassproteine übertragen werden um Hohlraumvolumina zu generieren die zu den sterischen Anforderungen von synthetischen Katalysatoren passen.

 
  Biohybridkatalysator Urheberrecht: Bio VI

Wenn man einen synthetischen Metallkatalysator in ein Proteingerüst einbaut, erhält man einen Biohybridkatalysator. Das Proteingerüst kann die Selektivität des Metallkatalysators potentiell verändern und macht es in Wasser löslich, ohne dessen breites Substratspektrum zu verlieren. Was an der Arbeit in dieser Publikation neu ist, ist das Proteingerüste für synthetische Katalysatoren bis jetzt hauptsächlich dadurch angepasst worden sind, dass einzelne Aminosäuren ausgetauscht wurden. Obwohl mit dieser konventiellen Strategie bisher viel erreicht wurde, wird sie durch die Anzahl an Aminosäuren im Protein begrenzt, die zum Austausch zur Verfügung stehen. In dieser Arbeit wurde Hohlraumvolumen-Engineering eines Beta-Fassproteins namens Nitrobindin betrieben, indem mehrere Beta-Stränge dupliziert wurden, um eine vergrößerte Variante zu generieren.

 
 

"Das Einbringen eines synthetischen Metallkatalysators in ein Proteingerüst ergibt einen Biohybridkatalysator, der Löslichkeit in Wasser mit dem breiten Reaktionsspektrum von organometallischen Katalysatoren vereint."

Alexander R. Grimm

Indem ganze Beta-Stränge dupliziert wurden, war es möglich große Katalysatoren kovalent einzubauen und exzellente Umsätze in einer ganzen Reihe an Olefinmetathesereaktionen – Kohlenstoff-Kohlenstoff Doppelbindungsausbildungsreaktionen – zu erzielen. Was daran so spannend ist, ist das die angewendete Designstrategie potentiell auf weitere Beta-Fassproteingerüste übertragen werden kann um Hohlraumvolumina zu generieren die zu den sterischen Anforderungen von synthetischen Katalysatoren passen. Wenn Hochdurchsatzdurchmusterung in Zukunft auf diese neuen Varianten angewendet wird, sollte es möglich sein gelenkte Biohybridkatalysatorevolution viel effizienter zu erforschen. Dies wird die synthetische Leistung wahrscheinlich noch weiter steigern. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung der Deutschen Forschungsgemeinschaft und das Bundesministerium für Bildung und Forschung ermöglicht.

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  Biohybridkatalysator Urheberrecht: ACS Catalysis Abbildung 1 Umsatz von generiertem Biohybridkatalysator nach Hohlraumvolumen-Engineering und proteinfreiem Katalysator in ringöffnender metathetischen Polymerisation
 
 

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Eine E.coli-Ganzzellplattform für künstliche Metalloenzyme: Polyphenylacetylen-Produktion mittels eines Rhodium-Nitrobindin-Metallproteins

Photo von Alexander Grimm Urheberrecht: Bio VI

Grimm, A.R., Sauer, D.F., Polen, T., Zhu, L., Hayashi T., Okuda J., Schwaneberg, U. (2018). A whole cell E. coli display platform for artificial metalloenzymes: polyphenylacetylene production with a rhodium-nitrobindin metalloprotein. ACS Catal., 8, 2611-2613.

 
 

Eine Ganzzell E. coli Displayplattform für artifizielle Metalloenzyme

 
  Funktionsweise des Ganzzellkatalysators Urheberrecht: Bio VI

In dieser Publikation unserer Kollegen aus der Abteilung Hybridkatalyse und Hochdurchsatz-Durchmusterungssysteme wurde der erste bakterielle zelloberflächendisplaybasierte Ganzzellbiohybridkatalysator generiert, charakterisiert und für die stereoselektive Polymerisation von Phenylacetylen angewendet. Ganzzellkatalyse ist für die kosteneffektive Produktion von Chemikalien mit biotechnologischen Mitteln sehr wichtig. Trotz der vielversprechenden Verwendung von ganzen Zellen für die Biohybridkatalyse, mussten Wissenschaftler bis dato feststellen, dass in ihren Experimenten wertvolle synthetische Metallkatalysatoren

 
 

in Zellen durch intrazelluläre Thiole inaktiviert wurden. Die Autoren haben die Oberfläche von Escherichia coli Zellen deshalb mithilfe eines esterasebasierten Autotransporters mit Rhodium-Nitrobindin Biohybridkatalysatoren aufgerüstet, um die Katalysatoren von inhibierenden intrazellulären Verbindungen zu trennen. Eine hohe Anzahl von 39.000.000 Umsätzen pro Zelle in der Polymerisation von Phenylacetylen und potentielle Anwendungen in der gelenkten Evolution und Hochdurchsatzdurchmusterung machen die vorgestellte Technologie zu einer attraktiven Plattform für bioorthonogale Reaktionen. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft und das Bundesministerium für Bildung und Forschung möglich gemacht.

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  Funktionsprinzip Ganzzellkatalysator Urheberrecht: Bio VI
 
 

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Ein enzymatischer Weg zu α-Tocopherol Synthonen: Aromatische Hydroxylierung von Pseudocumol und Mesitylen mittels P450 BM3

A.Denning/A.Weingartner Urheberrecht: Bio VI

Dennig*, A., Weingartner*, A. M., Kardashliev, T., Müller, C. A., Tassano, E., Schürmann, M., Ruff, A. J., Schwaneberg, U. (2017). Chemistry - European Journal , first published online: October 9 2017, DOI: 10.1002/chem.201703647

 
 

P450 BM3 Varianten für die Produktion von phenolischen Schlüsselbausteinen für die α-Tocopherol-Synthese

 
  Hydroxylierung durch P450 BM§ Urheberrecht: Wiley VCH

Vitamin E findet vielfältige Anwendung, wie zum Bespiel in Kosmetika, in der Lebensmittelindustrie und als Nahrungsergänzungsmittel. Aufgrund des wachsenden Bedarfes sind alternative Wege zur Herstellung von Vitamin E von industriellem Interesse. Mit unserer Arbeit zeigen wir die erste direkte aromatische Hydroxylierung von Pseudocumol und Mesitylen in Wasser, unter Luftsauerstoff und milden Reaktionsbedingungen für die Gewinnung von aromatischen Ausgangsbausteine für die Synthese von Vitamin E. Einer der wichtigsten, aromatischen Bausteine hierfür ist Trimethylhydroquinon - TMHQ. Die beschriebene P450 BM3 Variante M3 ist in der Lage TMHQ direkt von Pseudocumol ausgehend zu produzieren, was eine neue und umweltfreundlichere Vitamin E Synthese ermöglicht. Im Falle von Mesitylen kann eine P450 BM3 katalysierte Oxidation zur Herstellung von nützlichen Bausteinen beitragen, welche wiederum als Ausgangsstoff für die TMHQ Erzeugung genutzt werden können. Zusammenfassend beschreibt die Studie einen ersten enzymatischen Weg für die Herstellung von aromatischen Ausgangsbausteinen für die Vitamin E Synthese und erste katalytische und mechanistische Untersuchungen der direkten aromatischen Hydroxylierung von Trimethylbenzenen mit Luftsauerstoff.

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Umkehrung der Enantiopräferenz von cpADH5 und Veränderung der Kettenlängenspezifität für Methyl-3-Hydroxyalkanoate

Yunus Ensari & Gaurao Dhoke Urheberrecht: Bio VI

Yunus Ensari, Gaurao V. Dhoke, Mehdi D. Davari, Marco Bocola, Anna Joëlle Ruff, Ulrich Schwaneberg, Chemistry – A European Journal 2017, 23, 51, Issue, 12636-12645.

 
 

Die Vergrößerung der Substratbindetasche von cpADH5 führte zur Umsetzung von Methyl-3-Hydroxyalkanoaten mittlerer Kettenlänge und Umkehrung der Enantiomerpräferenz.

 
  cpADH5 Urheberrecht: Chemistry – A European Journal Schema 1: Allgemeiner Überblick über das Engineering der Bindetasche von cpADH5

Die selektive Oxidation von primären oder sekundären Alkoholen zu Carbonyl-Verbindungen, z.B. Aldehyden und Ketonen, ist eine Schlüsselreaktion in der organischen Synthese und in der Industrie. Die Oxidation von Alkoholen zu Ketonen kann mit einer Vielzahl von chemischen Oxidationsmethoden effizient durchgeführt werden. Jedoch stellen Selektivität, die Produktion ungewünschter Nebenprodukte, Substratspektrum und Umsetzungsraten bei der Oxidation von Alkoholen immer noch eine große Herausforderung dar. Alkoholdehydrogenasen sind vielversprechende Alternativen zu Metallkatalysatoren und katalysieren reversible Oxidationen von primären und sekundären Alkoholen zu deren korrespondierenden Aldehyden oder Ketonen.

Wir hoffen, dass die enzymatische Oxidation von 3-Hydroxy-FAMEs neuartige Synthesewege hin zu attraktiven Bausteinen für die Synthese von Pheromonen und Beta-Lactam-Antibiotika ermöglicht.

Gaurao V. Dhoke

Keton-funktionalisierte Fettsäurederivate sind vielseitige Verbindungen in der organischen Chemie, die als Intermediate und Bausteine in der Herstellung von u.a. pharmazeutischen Wirkstoffen und Detergentien genutzt werden.

Diese Studie stellt die erste durch Protein Engineering überarbeitete Candida parapsilosis Alkoholdeydrogenase - cpADH5 - vor, die Methyl 3-hydroxyhexanoat und Methyl 3-hydroxyoktanoat zu ihren entsprechenden Ketonen effizient oxidieren kann. Diese Reaktionen können durch den Wildtyp von cpADH5 nicht katalysiert werden. In dieser Studie wurde die Substratbindetasche von cpADH5 mutiert und neu designt, um ihr Substratspektrum auf 3-Hydroxy-Fettsäuremethylester – FAME – mit mittleren Kettenlängen von 6 bis 12 Kohlenstoffatomen auszudehnen. Des weiteren beschreiben wir die invertierte Enantiopräferenz der von uns genenerierten cpADH5 Variante für die Oxidation von Methyl-3-Hydroxybutyrat.

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Mikro-Lieferservice für Dünger

Mikro-Lieferservice für Dünger Urheberrecht: Wiley-VCH

Pflanzen können Dünger nicht nur über die Wurzeln, sondern auch über die Blätter aufnehmen. Über einen längeren Zeitraum gestaltet sich eine Blattdüngung jedoch schwierig. Deutsche Forscher stellen jetzt in der Zeitschrift Angewandte Chemie ein leistungsfähiges Zufuhrsystem für Mikronährstoffe auf Basis biohybrider Mikrogele vor. Spezielle Peptide verankern die „Mikrocontainer“ fest auf der Blattoberfläche, während Bindestellen im Inneren für eine verzögerte Abgabe der „Ladung“ sorgen.

Die Blattdüngung ist bereits Praxis, z.B. im Weinbau, wenn Reben aufgrund eines Mineralmangels gelbe Blätter bekommen. Trotz Verwendung von Detergenzien, Adhäsiven und Befeuchtungsmitteln ist eine kontrollierte Nährstoffzufuhr über mehrere Wochen per Blattdüngung aber kaum zu erreichen. Bis zu 80% der Nährstoffe werden abgewaschen, gelangen in den Boden und werden zum Großteil in Formen umgewandelt, die die Pflanze nicht nutzen kann. Zudem können sie in Gewässer gespült werden und Umweltprobleme verursachen. Ein weiteres Problem: Bei starker Sonneneinstrahlung verdunstet das Wasser der aufgetragenen Düngerlösung. Die entstehende hohe Salzkonzentration entzieht dem Blatt Wasser, was zu Verbrennungsschäden führen kann.

Das Team vom DWI-Leibniz-Institut für Interaktive Materialien, Aachen, der RWTH Aachen und der Universität Bonn hat jetzt ein Blattdünger-System auf Basis biokompatibler Mikrogele entwickelt, das lange und selektiv an Blättern haftet und Nährstoffe langsam und kontrolliert abgibt. Mikrogele sind winzige Partikel aus quervernetzen Makromolekülen, die Wasser und andere Moleküle wie Düngersubstanzen sehr effizient binden können.

Die Forscher um Ulrich Schwaneberg, Felix Jakob und Andrij Pich statteten die Gelpartikel im Inneren mit Bindestellen aus, die Eisen-bindenden Proteinen von Bakterien nachempfunden wurden. Sie sorgen dafür, dass Eisenionen nur langsam abgegeben werden. Die Mikrogele werden bei pH 3 mit eisenhaltiger Lösung beladen. Bei Erhöhung des pH-Wertes auf 7 schrumpfen sie unter Wasserabgabe und binden dabei das Eisen.

Die Oberfläche der Gelpartikel wurde mit Ankerpeptiden aus Milchsäurebakterien bestückt, die fest an Blattoberflächen haften und so ein Auswaschen verhindern. Da das Gel Wasser enthält, bildet sich eine wässrige Mikroumgebung, in der das Eisen in die Blätter diffundieren kann. Gelb gewordene Blätter unter Eisenmangel leidender Gurkenpflanzen wurden an Stellen, auf die der neuartige Blattdünger getropft wurde, rasch wieder grün.

Durch Ausstattung mit anderen Bindestellen könnten die „Mikrogel-Container“ mit einer Vielzahl an Metallionen oder Wirkstoffen beladen werden. Eine kontrollierte und bedarfsgerechte Freisetzung von Wirkstoffen, minimiert die benötigten Einsatzmengen und den Eintrag von Dünger und Pestiziden in die Umwelt. Dank geringer Produktionskosten, hoher Beladung, einfacher Handhabung sowie gezielt einstellbarer Adhäsionseigenschaften wäre ein breiter industrieller Einsatz denkbar. Ziel sind selbstregulierende Zufuhrsysteme für eine nachhaltige Landwirtschaft.

Richard A. Meurer et al, Biofunctional Microgel-Based Fertilizers for Controlled Foliar Delivery of Nutrients to Plants, Angewandte Chemie International Edition (2017). DOI: 10.1002/anie.201701620

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Herstellung von Bausteinen zur Synthese von Filtermembranen

Herstellung von Bausteinen zur Synthese von Filtermembranen Urheberrecht: Bio VI

Der Eisentransporter FhuA - Ferric hydroxamate uptake protein component A, ein Kanalprotein aus dem Bakterium Escherichia coli, wurde maßgeschneidert verändert für die Herstellung von synthetischen Membranen, die aus FhuA-Proteinen und Polymeren bestehen. Das Protein bildet einen durchlässigen Kanal mit einer einheitlichen Porengröße von 2,5 bis 3,0 nm und einer fassförmigen Struktur. Für die Anbindung von PNIPAAm-Polymerketten wurden Lysinreste an spezifischen Positionen ringförmig außerhalb vom Kanal oberhalb der Transmembranregion angeordnet. Dieses Design ermöglicht das Wachsen lassen von Polymerketten ausgehend vom äußeren FhuA-Kanal. Die hergestellten Bausteine aus FhuA-Kanalprotein und Polymerketten werden zukünftig verwendet hybride Membranen für die Nanofiltration zu synthetisieren. In diesem Verfahren können diese Membranen als molekulares Sieb zur Trennung verschiedener Moleküle verwendet werden, was in den Downstream-Prozessen zur Herstellung von Süßungsmitteln, Pestiziden und Medikamenten essentiell ist.

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In vitro flow cytometry-basiertes Durchmusterungssystem für Cellulase engineering

In vitro flow cytometry-based screening platform for cellulase engineering Urheberrecht: Bio VI

Screeningtechnologie ist von entscheidender Bedeutung, wenn Biokatalysatoren durch gerichtete Evolution verbessert werden sollen, denn bei jedem einzelnen Versuch entstehen gegebenenfalls Millionen von Varianten dieser Katalysatoren. Damit aber solche Versuche dennoch in vertretbaren Zeiträumen durchgeführt werden können, wurden Ultrahochdurchsatz-Screeningmethoden entwickelt. Solche Techniken sind in der Lage bis zu 107 Einzelreaktionen pro Stunde zu analysieren und können daher die Mutagenese einer kompletten Peptidsequenz eines Enzyms mit hoher Kosten- und Zeiteffizienz untersuchen.

Diese Technologie wird umso schlagkräftiger, wenn sie mit zellfreier Expression gekoppelt wird. Diese Expressionsmethode ermöglicht es dem Experimentator den Diversitätsverlust während der Transformation von Mutationsbibliotheken in die Expressionswirte zu reduzieren, sondern auch die Modifikation von Enzymen menschlichen und tierischen Ursprungs oder die direkte Evolution von Enzymen, die toxisch für die Expressionswirte sind.

Die erste funktionstüchtige Kombination aus zellfreier kompartimentalisierter Expression mit Hochdruchsatz-Screening wurde in der InVitroFlow-Technologie realisiert und bereits erfolgreich auf die gerichtete Evolution von Cellulase-Enzymen angewandt.

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Durchmusterung einer Promoter Toolbox zur Erhöhung der Proteinproduktion in Escherichia coli

Screening through the PLICable promoter toolbox enhances protein production in Escherichia coli Urheberrecht: Bio VI

Escherichia coli ist ein häufig verwendeter Organismus für die rekombinante Proteinproduktion. Die Produktkonzentration ist hängt allerdings stark vom verwendetedn Expressionssystem ab. Promotoren sind deshalb ein Schlüsselelement für die Kontrolle des Expressionslevels. Diese Studie beschreibt die Entwicklung einer neuartigen „PLICbaren“ Promotoren „Werkzeugkiste“, die es ermöglicht, in nur einem Klonierungsschritt und nach einem Screening-Versuch den am besten geeigneten Promotor aus einer Auswahl aus zehn IPTG induzierbaren Promotoren (T7, A3, lpp, tac, pac, Sp6, lac, npr, trc und syn) zu identifizieren und somit Proteinproduktion in hohen Konzentrationen erlaubt.

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