Forschungshighlights

 

Grafting PNIPAAm from β-barrel shaped transmembrane nanopores

Grafting PNIPAAm from β-barrel shaped transmembrane nanopores Bio VI

Die Kombination der einzigartigen Eigenschaften von Transmembranproteinen (z.B. die Erhaltung von Membranpotentialen oder die Translokation von Stoffen) mit den spezifischen Fähigkeiten von Polymeren (z.B. die Steuerbarkeit durch Temperatur- oder pH-Stimuli) ermöglicht neue Anwendungen. Zwei etablierte Strategien existieren, um diese Protein-Polymer-Konjugate zu generieren: Während der „Grafting-to“ Ansatz vor-synthetisierte Polymere an das Protein bindet, werden bei der „Grafting-from“ Strategie Monomere direkt vom Protein aus polymerisiert. Die Konjugatbildung ausgehend von globulären Proteinen ist gut erforscht. Allerdings wurden zuvor noch keine solcher Konjugate basierend auf Transmembranproteinen gebildet. Hier beschreiben wir die Bildung von Trensmembranprotein-Polymer Konjugaten unter Verwendung des β-barrel Proteins FhuA (ferric hydroxamate uptake protein component A) – einem Protein der äußeren Zellmembran von Escherichia coli.

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In vitro flow cytometry-based screening platform for cellulase engineering

In vitro flow cytometry-based screening platform for cellulase engineering Bio VI

Screeningtechnologie ist von entscheidender Bedeutung, wenn Biokatalysatoren durch gerichtete Evolution verbessert werden sollen, denn bei jedem einzelnen Versuch entstehen gegebenenfalls Millionen von Varianten dieser Katalysatoren. Damit aber solche Versuche dennoch in vertretbaren Zeiträumen durchgeführt werden können, wurden Ultrahochdurchsatz-Screeningmethoden entwickelt. Solche Techniken sind in der Lage bis zu 107 Einzelreaktionen pro Stunde zu analysieren und können daher die Mutagenese einer kompletten Peptidsequenz eines Enzyms mit hoher Kosten- und Zeiteffizienz untersuchen.

Diese Technologie wird umso schlagkräftiger, wenn sie mit zellfreier Expression gekoppelt wird. Diese Expressionsmethode ermöglicht es dem Experimentator den Diversitätsverlust während der Transformation von Mutationsbibliotheken in die Expressionswirte zu reduzieren, sondern auch die Modifikation von Enzymen menschlichen und tierischen Ursprungs oder die direkte Evolution von Enzymen, die toxisch für die Expressionswirte sind.

Die erste funktionstüchtige Kombination aus zellfreier kompartimentalisierter Expression mit Hochdruchsatz-Screening wurde in der InVitroFlow-Technologie realisiert und bereits erfolgreich auf die gerichtete Evolution von Cellulase-Enzymen angewandt.

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Screening through the PLICable promoter toolbox enhances protein production in Escherichia coli

Screening through the PLICable promoter toolbox enhances protein production in Escherichia coli Bio VI

Escherichia coli ist ein häufig verwendeter Organismus für die rekombinante Proteinproduktion. Die Produktkonzentration ist hängt allerdings stark vom verwendetedn Expressionssystem ab. Promotoren sind deshalb ein Schlüsselelement für die Kontrolle des Expressionslevels. Diese Studie beschreibt die Entwicklung einer neuartigen „PLICbaren“ Promotoren „Werkzeugkiste“, die es ermöglicht, in nur einem Klonierungsschritt und nach einem Screening-Versuch den am besten geeigneten Promotor aus einer Auswahl aus zehn IPTG induzierbaren Promotoren (T7, A3, lpp, tac, pac, Sp6, lac, npr, trc und syn) zu identifizieren und somit Proteinproduktion in hohen Konzentrationen erlaubt.

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